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qEV /
エクソソーム抽出キット特長

qEV エクソソーム抽出キット

エクソソーム、extracellular vesiclesを短時間で分離・精製

qViro-X 生体用ナノパーティクル計測器

ISO 13485 取得

 ISO 13485 は、国際的に認められた衣料製品のみ得ることができる規格です。 qEV / qEV single共に取得しています。

qNano/qViroと使用することで、高効率高精度な解析を実現

全体の手順(精製+解析)は1時間未満

 エクソソームは生物性の流体で、量的な分析を行う前に、複雑なバックグラウンドタンパク質を除外する必要があります。 qEVを使用することで、迅速に浄化することが可能です。 qEVはサイズ除外でクロマトグラフィーの手法を使用し、 凝集せずに、急速で、高く浄化することによって、容易に費用効果が高い作業が行えます。

 通常EVの分離は数時間~1日以上かかりますが、qEVでは15分の短時間で抽出が完了します。 その後のqNanoによる解析は、キャリブレーションも含め通常20分で終了し、迅速にデータ解析とPDFレポートの作成ができるため、全体の手順(精製+解析)は1時間未満で簡単に終わらせることができます。

全体の手順(精製+解析)は1時間未満

高精度な解析を実現

qEVと他手法の比較
手法 作業時間 抽出結果
超遠心分離法数時間細胞残屑が残りコンタミとなる。
密度勾配沈殿法数時間細胞残屑が残りコンタミとなる。
分離試薬十数分凝集やコンタミが問題となる。
qEV15分以下凝集やコンタミなく、高濃度で精製可能。

 qEVの分離システムSEC (EVのサイズ排除クロマトグラフィー)はEVの構造の完全性を保ち、綺麗な分布を出すことで、EVを常に測定できます。 超遠心分離法と密度勾配沈殿法はどちらも、不一致性・コンタミ・凝集の問題を含む様々な理由により、分離メソッドに不適です。
 また、EVは物理的サイズが小さく不均質であるため、共焦点顕微鏡法/フローサイトメトリー/動的光散乱(DLS)/ナノ粒子トラッキング解析(NTA)/電子顕微鏡法(EM)を含む多くの解析技術において、制限を受けることにもなります。EMではEVの問題を解決できますが、定量的・ルーティンのスクリーニングに実用的でなく、真空により粒子を変えてしまいます。

qNanoでの測定メソッドと結果

サンプルの前準備
 以下アプリケーションでは、細胞外小胞(EV)は羊の脳脊髄液と人間の血漿から得たものを利用しました。どのサンプルも、一連の10分間の遠心分離ステップを3回実施することで(脳脊髄液 1500g, 3000g, 10,000g; 血漿 1500g, 3000g, 3000g。どちらの場合も上澄みはとどめている)、残存細胞破片を取り除きました。事前に平衡を保った標準qEVカラムには50uLのサンプルを入れ、500uL分が集められました。EVは通常7-9の区分で溶出します( Figure 1参照)


qNanoのセットアップ
 それぞれの測定は、qNanoとIzonソフトウェア バージョン3.1を用いて行われました。下部フルイドセルには電解液(75uL)が含まれ、上部フルイドセルには35uLのサンプルが含まれていました。qNano解析の前に、どのサンプルも先述のqEVカラムで精製しました。各サンプル測定毎にPBS(35uL)を上部フルイドセルに複数回入れてシステムを洗浄し、残存粒子が別のサンプル測定時に残らないようにしました。

qNanoでの測定メソッドと結果(サンプルの前準備

 このような電気抵抗ナノパルス法を用いた装置に関する詳細な記述な別の箇所に記載があります。ポアは濃度が分かっている200nm (平均210nm)のCPCポリスチレン粒子( 5.0 x 109/mL )を用いて3つの圧力を与えることによって(10, 8, 5 cmH2O)キャリブレーションしました。サンプルは同じ電圧と圧力において、一貫したベースライン電流を用いて解析し(例: 135 nA ± 2-5% max .)、各測定の間の比較データセットが有効なものとなるようにしました。

qNanoでの測定メソッドと結果(サンプルの前準備

CSF及び血漿サンプルのTRPS解析
 qEV分のCSFおよび血漿サンプルは電解液で希釈され、上述の通りqNanoで解析します。血漿及びCSFのEVはqEVの7-9の分量に溶出し、ピークの分量は血漿の場合F8に含まれており、CSFの場合はF9に含まれていました(Figure 1)。一部のEVはF10で溶出しましたが、この分量だと通常タンパク質にさらに汚染されますので、通常無視されます。典型的な粒子サイズのグラフと濃度データはFigure2の通りです。 生物学的サンプルが低レベルのEVを含んでいる場合は、スピンフィルターを用いた更なる濃度のステップがqEVによる精製前もしくは後に必要となります。これは尿サンプル/細胞培養の上澄み/凍ったヒトのCSFサンプルによくあることです。

EVの生物学/形態学の特長を保持したまま分離可能

 下図の2つのサイズ分布プロファイルの比較により、qEVによる精製ではEVのサイズ分布プロファイルに大きな影響を全く与えないことがわかります。 予想通り、細胞残屑などが処理された分、濃度の減少が一部見られます。

CSFサンプル qEV処理前後比較

CSFサンプル qEV処理前後比較

血清 qEV処理前後比較

血清 qEV処理前後比較

分析・測定の感度と精度の向上

分析・測定の感度と精度の向上

 qEVサイズ分離カラムにはポアサイズ約75nmの樹脂が含まれています。 EVより小さいタンパク質、及びコンタミとなる分子は、樹脂のポアに入りカラム内の通路で遅れ、 後のフラクションで溶離します。

qEVでの分離を行う時間は、2つの要素から成り立っています
1. カラムをつり合わせるための準備時間(通常10分)
2. サンプルの抽出時間(約5分)

タンパク質の除去

    

 理想的な環境下においては、小胞の SEC 精製によってコンタミとなるタンパク質を99 % 除去できます。(※SEC = サイズ排除クロマトグラフィー)

脂質の除去

 超遠心分離法の重大な問題は、HDL / LDL粒子の密度がEVの密度と類似していることにより、 粒子がEVと共に分離してしまうことがよくあることです。 EVから適切なフラクションを収集すると、EVサンプルからコンタミとなるHDLを95%まで除去することができます。

 左のグラフはqEVカラムによる溶出結果を280nmのUV吸収で測定されたバックグラウンドにあるタンパク質及び成分です。 EVはフラクション7-9ににかけて溶離しており、タンパク質はフラクション10-30で検出されています。

<qEV single>サンプル容量100μL 分析スケールのサンプルに

qEV single
  • 分析スケールのサンプル容量(100μL)
  • 大規模臨床研究のために設計されました
  • 分単位で信頼性の高いEV分離
  • エキソソームRNA分析用に最適化
  • より高いスループットのためのqEVロータリーホルダーとの互換性
  • ISO 13485品質基準に製造

qEV Singleの溶出プロファイル

 qEV singleは、複雑な生物学的流体または濃縮された細胞培養上清の100 μL からEVの迅速な単離を可能にします。 分析スケールのサンプル用に設計された qEV で、効率的にアッセイ(例えば、TRPS、タンパク質プロファイリング、RNA プロファイリングなど)の感度および精度を向上させるために、バックグラウンドのタンパク質、脂質、溶質、細胞の破片、および他の粒子を除去します。 qEV single は、操作の一貫性を保証し、臨床使用のための要件である ISO 13485 認定の品質基準に準拠しています。また、より大きなサンプル容積( 500 μL )と複数の利用(最大5回)に指定されている既存の標準 qEV SEC カラムを補完します。

<RK-1リガントキット>ナノポアへの非特異的結合を抑えます

RK-1リガントキット
  • 測定結果の濃度差を最小限に抑えます。
  • ポアの目詰まりを解消します。

RK-1使用時と未使用時の比較

RK-1使用時と未使用時の比較
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