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qEVシリーズ /
細胞外小胞抽出キット特長

qEV 細胞外小胞抽出キット

医療機器の品質マネジメント国際標準規格ISO 13485 を取得
日本で唯一!ISO規格で保証された細胞外小胞抽出キット
※ qEV、AFCは基礎的研究目的で使用願います。臨床、医療行為には使用できません。

第2世代qEVカラム登場!
独自開発の樹脂で細胞外小胞の純度のさらなる向上を実現

サブスクリプションで使い放題はじめました。

この度メイワフォーシスでは、『qNano ナノ粒子マルチアナライザー』、『qEV 細胞外小胞抽出キット』&『AFC qEV用自動回収装置』を定額で使用いただける、サブスクリプションサービスを開始しました。台数限定のサービスとなっておりますので、ご興味ございましたら、当社までお問合せください。サービスの詳細はこちらのページをご覧ください。

第2世代qEVカラム登場! 独自開発の樹脂で細胞外小胞の純度のさらなる向上を実現

 サイズ排除クロマトグラフィー法を用いた分離のためのqEVカラムの改良版である【 Gen 2 】を発表しました。
 新シリーズのqEVカラムは、独自に開発したアガロース樹脂を使用しており、細胞外小胞(EV)を含む溶出液をより精製することができます。今回の第2世代qEVカラムの発売は、サンプルの純度がダウンストリームの結果に大きな影響を与えるEVの研究やアプリケーションの分野が急速に拡大していることを受けてのものです。

以前よりも多くのタンパク質を除去

以前よりも多くのタンパク質を除去

 Gen 2カラムに使用されている独自の樹脂は、図1に示すように、ロードされたサンプルからより多くのタンパク質を除去することができます。

左図は、AFC オートフラクションコレクターを使用して分離したヒト血漿サンプル(2 mL)に含まれるタンパク質を、アプライされたタンパク質全体に対する割合を示しています。タンパク質はビシンコニン酸アッセイで測定しました。70nmシリーズおよび35nmシリーズのqEV original LegacyカラムおよびGen 2 qEV originalカラムのデータを示しています(0.5 mLのローディングボリューム)。

細胞外小胞/タンパク質比率向上で真のEVタンパク評価を

第2世代qEVカラムによりEVの純度が向上したことは、EVとタンパク質の比率を比較することでも証明されています。EVの数は、粒子単位での分析を可能にするExoidナノ粒子マルチアナライザー(TRPS法:Tunable Resistive Pulse Sensing)によって得られました。図2は、レガシーカラムと第2世代カラム( Gen2)の分離能力を示しています。

細胞外小胞/タンパク質比率向上で真のEVタンパク評価を

 Tunable Resistive Pulse Sensingとbicinchoninic acid assayでそれぞれ測定したタンパク質1μgあたりの細胞外小胞(EV)の数を示しています。左図は、Izonの自動フラクションコレクター(AFC)と、70 nmおよび35 nmシリーズのqEV originalカラム(ロードボリューム0.5 mL)を用いて分離したヒト血漿サンプルについて示しています。

Gen 2カラムでは分離が強化されているため、より精製されたEV含有サンプルを得ることができます。

ダウンストリーム分析に合わせてサンプルの組成を調整

 また、精製された抽出液量(PCV)の純度が高まることには、もう一つの大きなメリットがあります。分離が改善されたことで、より多くのフラクションからEVのみを抽出することができ、新しいレベルのコントロールが可能になりました。以下に示すように、抽出後の分析目的に合わせて、異なるPCVを選択することができます。

ダウンストリーム分析に合わせてサンプルの組成を調整

(A) Gen 2 qEV original/35 nmカラムとオートフラクションコレクター(AFC)を用いて分離したヒト血漿サンプルの溶出プロファイル。粒子数(バー)はExoidで測定し、タンパク質はビシンコニン酸アッセイで測定した(点線)。色あせたバーは、様々なプールボリュームからの計算と比較に基づく推定細胞外小胞(EV)濃度を示しています。用途や分析方法に応じて、異なる抽出液量(PCV)を選択し、サンプルを最適化することができます。
(B) EV濃度、(C) EV回収率、(D) EV純度のいずれかを優先するために、異なるPCVをプールすることができます。
(E) 推奨されるデフォルト設定では、EVの回収率と純度のバランスを優先します。ユーザーマニュアルには、いつ、どのようにAFCの設定を調整する必要があるかについてのガイダンスが記載されています。

第2世代 qEV original / 70 nm カラムのさらなる利点

Gen 2 qEV original / 70 nmカラムは、Legacyカラム(Legacy qEV original / 70 nm)と比較して、より高いEV濃度を実現します。

細胞外小胞/タンパク質比率向上で真のEVタンパク評価を

 左図は、ヒト血漿サンプル(0.5 mL)をLegacy qEV original / 70 nmカラムとGen 2 qEV original / 70 nmカラム(2 mL)で抽出した際の1 mLあたりの細胞外小胞(EV)の数の比較です。
抽出はAFCオートフラクションコレクターを用いて行い、EV濃度はEoxidナノ粒子マルチアナライザー(TRPS:Tunable Resistive Pulse Sensing)によって得ました。

1mLのサンプルロード量に最適化された新しいカラム

最初に発売される第2世代qEVカラムは、サンプル量500μlのqEVoriginal Gen2と、サンプル量1mLに最適化されたqEV1です。どちらも既存の35nmおよび70nmシリーズで、最適な回収範囲はそれぞれ35~350nmおよび70~1,000nmとなっています。qEV1は、少量のサンプルを扱う多くの研究者、特にEV-RNAやバイオマーカーの発見・開発に関心のある研究者にとって貴重な製品となります。

qEVアイソレーション・プラットフォームの進化

2014年にqEVoriginalを初めて発売して以来、既存のLegacyカラムシリーズは、qEVsingle(2016年)、qEV2およびqEV10(2018年)、qEV100(2019年)など、さまざまなサンプルローディング量に合わせて拡張されてきました。それ以来、qEVカラムは、血漿、細胞培養上清、脳脊髄液、気管支肺胞洗浄液などの多様なサンプルタイプの研究に使用されています。2019年にAFCオートフラクションコレクターが導入されたことで、労働集約的な手作業による採取から、より大規模なバイオマーカー研究のためにスケールアップできる迅速かつ再現性の高い方法へと大きく変化しました。第2世代のqEVカラムのリリースは、EV診断のための研究など、EVアプリケーションのためのスケーラブルな方法を提供いたします。

1mLサンプル用に最適化された新しいqEVカラム

qEV1は1mLのサンプルに最適化された 新しいサイズ排除除去(SEC)カラム

新登場した「qEV 1」は第2世代のアガロース樹脂を用いていることに加え、研究の中で一般的なサンプル量「1mL」に最適化したカラムとなっています。新しいカラムは、従来のqEVで使用されているレジンと比較して、分離が改善された独自のアガロースレジンで構築されています。   qEV1は、臨床研究、一般研究、EVバイオマーカー開発、およびサンプルコンソーシアムで得られる一般的なサンプル量である1mLサンプル用に最適化されたカラムに対する強い需要を満たすために開発されました。   これまでのqEVラインナップでは、サンプル量1 mLの場合、qEVoriginalで0.5mLに取り分け2回行うか、qEV2を選択する必要がありました。1 mLのサンプルをqEV2にロードすると、 2mLサンプル用に設計されているため、不要なサンプル希釈が 発生していました。   1 mLサンプル専用カラムに対する強い要望によりqEVシリーズのラインナップに加わりました。

qEV1は第2世代の独自開発の樹脂を採用

qEV1は第2世代の2qEVカラムで使用される新しい独自樹脂の開発によって可能になりました。 サンプルに最適なカラムサイズを選択することは、EVの回収率と純度を最大化するために重要です。これは、抽出後の分析精度を最大化するのに役立ちます。   以下の図は、EV研究者がqEVoriginal(レガシーカラム、1 mLローディングボリューム)と比較してqEV1(1 mLローディングボリューム)から期待できる改善された純度を示しています。

   

上図は、AFCオートフラクションコレクターを使用してヒト血漿サンプルから抽出した精製サンプルに存在するタンパク質量の比較です。
ロードされた総タンパク質の割合をパーセンテージとして示しています。 アプライしたサンプル量は、すべてのカラムで1mLでした。タンパク質はビシンコニン酸アッセイによって測定されました。 qEV1およびqEVoriginal Legacyカラムを使用して抽出したサンプルデータをA)35 nmシリーズ、B)70nmシリーズ共に示しています。

上図は、タンパク質1µgあたりのEVの数。 粒子数は、粒子ごとの分析のためにIzonのExoidを使用して測定されました。 ロードされたサンプル量はすべてのカラム(ヒト血漿)で1 mLであり、タンパク質はビシンコニン酸アッセイによって測定されました。 qEV1とqEVoriginal Legacyカラムを使用したデータを示しています。(A)35 nmシリーズB)70nmシリーズ)

 qEV1は、qEVoriginalとqEV2の間に以前存在していたギャップを埋め、第2世代の樹脂を用いることことで高純度の抽出を実現しました。
 また、AFC オートフラクションコレクター によって自動化と再現性の高い抽出と共に、1mLのローディングボリュームから EVを分離するための非常に効果的な方法を提供します。
 qEV1で使用される新しい樹脂は、すべての第2世代のqEVカラムを使用しています。第2世代の抽出レンジは、従来と同じ回収範囲(35nmシリーズ:35〜350 nm、70nmシリーズ:70〜1000 nm)で利用できます。

qEVシリーズに新製品が追加!35~350nmの細胞外小胞抽出に特化した新モデル

 カラム内のポアの径が35nmの「 qEV 35nm 」新モデルが登場しました。35 ~ 350nm のサイズに特化した細胞外小胞抽出を実現しました。

新製品 qEV35 と 従来品 qEV70 の比較

qEV35と70の比較データ

 左図は従来の製品 qEV70 と新製品 qEV35 の抽出結果を比較しました。 赤いラインが qEV70 と同じ割合を示します。 qEV35 は70 nm、57 nm、40 nmで qEV70 の1.5 倍 ~ 2.5 倍の回収量を実現しています。
 qEV35 がより小さな粒子を抽出することに特化していることがわかります。

 57 nmの粒子と200 nmの粒子を qEV35 と qEV70 で抽出を行い比較しました。
 57nm の粒子はqEV35 で抽出した場合、EV ZONE で大半の粒子が抽出できているとこがわかります。 qEV70 は EV ZONE 以降でも粒子が抽出されているため、57nm 付近の粒子抽出にはqEV35 が最適なことがわかります。
 200nm の粒子は qEV70 も大半の粒子がEV ZONE で抽出されていることがわかります。
 上記の様に、目的の粒子サイズにより最適な qEV の種類をお選びいただけます。

研究用途やサンプル量により、10種類から最適なキットをお選びいただけます

qEV Singleの溶出プロファイル

 qEV singleは、複雑な生物学的流体または濃縮された細胞培養上清の100 μL からEVの迅速な単離を可能にします。 分析スケールのサンプル用に設計された qEV で、効率的にアッセイ(例えば、TRPS、タンパク質プロファイリング、RNA プロファイリングなど)の感度および精度を向上させるために、バックグラウンドのタンパク質、脂質、溶質、細胞の破片、および他の粒子を除去します。 qEV single は、操作の一貫性を保証し、臨床使用のための要件である ISO 13485 認定の品質基準に準拠しています。また、より大きなサンプル容積( 500 μL )と複数の利用(最大5回)に指定されている既存の標準 qEV SEC カラムを補完します。

qNanoと使用することで、高効率高精度な解析を実現

全体の手順(精製+解析)は1時間未満

 細胞外小胞は生物性の流体で、量的な分析を行う前に、複雑なバックグラウンドタンパク質を除外する必要があります。 qEVを使用することで、迅速に浄化することが可能です。 qEVはサイズ除外でクロマトグラフィーの手法を使用し、 凝集せずに、急速で、高く浄化することによって、容易に費用効果が高い作業が行えます。

 通常EVの分離は数時間~1日以上かかりますが、qEVでは15分の短時間で抽出が完了します。 その後のqNanoによる解析は、キャリブレーションも含め通常20分で終了し、迅速にデータ解析とPDFレポートの作成ができるため、全体の手順(精製+解析)は1時間未満で簡単に終わらせることができます。

全体の手順(精製+解析)は1時間未満

qEVは高精度な解析を実現( qEV と他手法の比較)

手法 抽出方法 デメリット
超遠心法超遠心装置を使用し、ペレットダウン法、スクロール法、密度勾配法で抽出。超遠心装置が高額で、1回の作業に数時間から十数時間かかる。抽出結果の再現性が低い。
PEG 沈殿法PEGで細胞外小胞を凝集させ分離する方法。細胞外小胞以外の物質も多く含む。
PEGが抽出物に入る。
磁気ビーズ法細胞外小胞に磁気ビーズを反応させ、磁気によりビズを分離。磁気ビーズが細胞破砕物にも結合してしまう。
細胞破砕物も一緒に回収してしまう。
抗体法抗体を細胞外小胞表面に結合させ、抽出を行う。細胞外小胞表面には様々なタンパク質が付着している。抗体と反応する細胞外小胞しか回収できない。
SEC 法 ( qEV )qEVの手法。サイズ排除により狙ったサイズの粒子を抽出。 ISO13845を取得しているのはqEVだけ。
短時間で誰でも再現性のあるピュアな細胞外小胞抽出が可能。

 qEVの分離システムSEC (EVのサイズ排除クロマトグラフィー)はEVの構造の完全性を保ち、綺麗な分布を出すことで、EVを常に測定できます。 超遠心法とPEG 沈殿法はどちらも、不一致性・コンタミ・凝集の問題を含む様々な理由により、分離メソッドに不適です。
 また、EVは物理的サイズが小さく不均質であるため、共焦点顕微鏡法/フローサイトメトリー/動的光散乱(DLS)/ナノ粒子トラッキング解析(NTA)/電子顕微鏡法(EM)を含む多くの解析技術において、制限を受けることにもなります。EMではEVの問題を解決できますが、定量的・ルーティンのスクリーニングに実用的でなく、真空により粒子を変えてしまいます。

qNanoでの測定メソッドと結果

サンプルの前準備
 以下アプリケーションでは、細胞外小胞(EV)は羊の脳脊髄液と人間の血漿から得たものを利用しました。どのサンプルも、一連の10分間の遠心分離ステップを3回実施することで(脳脊髄液 1500g, 3000g, 10,000g; 血漿 1500g, 3000g, 3000g。どちらの場合も上澄みはとどめている)、残存細胞破片を取り除きました。事前に平衡を保った標準qEVカラムには50uLのサンプルを入れ、500uL分が集められました。EVは通常7-9の区分で溶出します( Figure 1参照)


qNanoのセットアップ
 それぞれの測定は、qNanoとIzonソフトウェア バージョン3.1を用いて行われました。下部フルイドセルには電解液(75uL)が含まれ、上部フルイドセルには35uLのサンプルが含まれていました。qNano解析の前に、どのサンプルも先述のqEVカラムで精製しました。各サンプル測定毎にPBS(35uL)を上部フルイドセルに複数回入れてシステムを洗浄し、残存粒子が別のサンプル測定時に残らないようにしました。

qNanoでの測定メソッドと結果(サンプルの前準備

 このような電気抵抗ナノパルス法を用いた装置に関する詳細な記述な別の箇所に記載があります。ポアは濃度が分かっている200nm (平均210nm)のCPCポリスチレン粒子( 5.0 x 109/mL )を用いて3つの圧力を与えることによって(10, 8, 5 cmH2O)キャリブレーションしました。サンプルは同じ電圧と圧力において、一貫したベースライン電流を用いて解析し(例: 135 nA ± 2-5% max .)、各測定の間の比較データセットが有効なものとなるようにしました。

qNanoでの測定メソッドと結果(サンプルの前準備

CSF及び血漿サンプルのTRPS解析
 qEV分のCSFおよび血漿サンプルは電解液で希釈され、上述の通りqNanoで解析します。血漿及びCSFのEVはqEVの7-9の分量に溶出し、ピークの分量は血漿の場合F8に含まれており、CSFの場合はF9に含まれていました(Figure 1)。一部のEVはF10で溶出しましたが、この分量だと通常タンパク質にさらに汚染されますので、通常無視されます。典型的な粒子サイズのグラフと濃度データはFigure2の通りです。 生物学的サンプルが低レベルのEVを含んでいる場合は、スピンフィルターを用いた更なる濃度のステップがqEVによる精製前もしくは後に必要となります。これは尿サンプル/細胞培養の上澄み/凍ったヒトのCSFサンプルによくあることです。

EVの生物学/形態学の特長を保持したまま分離可能

 下図の2つのサイズ分布プロファイルの比較により、qEVによる精製ではEVのサイズ分布プロファイルに大きな影響を全く与えないことがわかります。 予想通り、細胞残屑などが処理された分、濃度の減少が一部見られます。

CSFサンプル qEV処理前後比較

CSFサンプル qEV処理前後比較

血清 qEV処理前後比較

血清 qEV処理前後比較

分析・測定の感度と精度の向上

分析・測定の感度と精度の向上

 qEVサイズ分離カラムにはポアサイズ約75nmの樹脂が含まれています。 EVより小さいタンパク質、及びコンタミとなる分子は、樹脂のポアに入りカラム内の通路で遅れ、 後のフラクションで溶離します。

qEVでの分離を行う時間は、2つの要素から成り立っています
1. カラムをつり合わせるための準備時間(通常10分)
2. サンプルの抽出時間(約5分)

タンパク質の除去

    

 理想的な環境下においては、小胞の SEC 精製によってコンタミとなるタンパク質を99 % 除去できます。(※SEC = サイズ排除クロマトグラフィー)

脂質の除去

 超遠心分離法の重大な問題は、HDL / LDL粒子の密度がEVの密度と類似していることにより、 粒子がEVと共に分離してしまうことがよくあることです。 EVから適切なフラクションを収集すると、EVサンプルからコンタミとなるHDLを95%まで除去することができます。

 左のグラフはqEVカラムによる溶出結果を280nmのUV吸収で測定されたバックグラウンドにあるタンパク質及び成分です。 EVはフラクション7-9ににかけて溶離しており、タンパク質はフラクション10-30で検出されています。

新登場!qEVカラム用自動回収装置<AFC>

qEV 細胞外小胞抽出キット
  • qEV(細胞外小胞抽出キット)とqNano(ナノ粒子マルチアナライザー)セットで使用し、高精度細胞外小胞解析は1時間以内に完了!
    誰も簡単・短時間に抽出可能

  • 自動の電子弁と重量検知のため、作業による差も発生しにくくなり、
    これまで以上の再現性を実現

  • RFIDタグ(情報を保存できるICタグ)があり、製造およびQAデータ、仕様回数やクリーニングサイクルを管理

<RK-1リージェントキット>ナノポアへの非特異的結合を抑制

RK-1リージェントキット
測定結果の濃度差を最小限に抑え、ポアの目詰まりを解消します。

RK-1使用時と未使用時の比較 RK-1使用時と未使用時の比較
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