NanoFCM ／
フローナノアナライザーアプリケーション

　NanoFCMは単一分子レベルで検出できる高感度センサー(SPCM)を搭載しています。
　EV 1 粒子ごとに内在性蛍光および蛍光標識の両方を計測し、蛍光EV集団と非蛍光集団を判別・解析することが可能です。
タンパク質、核酸、脂質も単一粒子での評価が可能で、蛍光シグナル強度でその存在の 相対量を計測し、EV 1 粒子においての表現型決定(フェノタイピング)を可能にします。

　上のグラフはEV固有のマーカーのモデルタンパク質としてCD9およびCD63を使用し、CD9の存在は免疫蛍光標識、CD63の存在はCD63-EGFPクローンから抽出された EVを分析することによって確認した事例です。 蛍光集団と非蛍光集団を認識することができ、EVの存在量を定量評価することが可能です。

　EVは内部および表面にRNA、DNA、タンパク質、脂質、および代謝産物を含んでおり小胞貨物 に例えられます。
このEVカーゴはレシピエント細胞に移され多面的な反応をもたらします。 このＥＶの機能は、組成を測定することによって、または機能を評価することができます。

　上のグラフはSYTO RNASelect蛍光染色を用いてEV内のmRNAとmiRNAを標識し、 PKH26を用いてEV表面の脂質を標識した事例です。 蛍光標識したEVと非蛍光粒子を識別することが可能になります。

　細胞外小胞(EV)は、その遺伝子情報から疾患の証拠となり得ます。EVの表面タンパク質の蛍光解析が可能なNano FCMは、EVの診断および治療の可能性を評価するための強力なツールです。
　Nano FCMは、単一のEVの側方散乱光および蛍光信号を同時に取得することを可能にし、さらに、EVの全サイズレンジの計測も可能にした唯一のフローサイトメトリーです。 免疫蛍光標識後、Nano FCMの分析結果により、癌などの疾患において、非侵襲的早期診断が実現可能となります。

　参考文献:[1] S Zhu, et al. ACS Nano, 2014, 8, 10998-11006. [2] Y. Tian, et al. ACS Nano, 2018, 12, 671-680.

　フローサイトメーターは液中の細胞および微小粒子におけるハイスループット、マルチパラメータ、定量分析のための確立された技術です。一般に使用されているフローサイトメーターでは蛍光トリガを使用して個々のEV表面タンパク質を分析ことが可能ですが、従来型のフローサイトメーターでは最小で150nm程度までの粒子しか測定することができず、EVの評価という点では検出サイズにおいて課題がありました。
　一方で、NanoFCM フローナノアナライザーは散乱光を使用した独自の解析手法により、 直径40〜150nmにおけるEVの多パラメータ分析に対応し、なおかつ単一蛍光を十分に検出することができます。さらにNanoFCMのソフトウェアにおいては蛍光粒子と非蛍光粒子のゲーティング解析によってそれぞれのサイズ、濃度、全粒子に対する割合を容易に解析することが可能です。
　この結果では全粒子においては50nmと80nmの2か所にピークが得られていますが、FITCによって蛍光染色されているEVは約80nmの単一ピークであることがわかります。これまでの装置では解析することのできなかったナノ粒子における個別粒子解析を装置一台で提供することができます。

　地球上に最も多様に存在するウイルスは、我々の生活に大きな影響をあたえています。 しかし、主に直径20～200nmと、ウイルスのサイズが小さく、構造が単純であるため、200nmを超える粒子がターゲットとなる従来のフローサイトメトリーでは、ウイルスの検出は難しい場合があります。
　動物感染ウイルスは、多くの致命的疾患の原因となり、植物感染ウイルス病原体は、世界中の作物の病害のもとになる一方、ウイルス遺伝子治療ベクターとして、多くの生物学の研究に利用されております。

　サンプルとして非エンベロープウイルスであり、直径27㎜の正20面体一本鎖 (+) RNAウイルスであるレビウイルスMS2(バクテリオリオファージMS2）を使用し、NanoFCMでのラベルフリー計測を行いました。
1分間に検出されたすべてのナノ粒子の平均シグナル強度とバックグラウンド信号（ノイズ）の標準偏差から算出したS/N比は11であり、NanoFCMはバックグラウンドノイズに対してMS2ウイルスを高い感度で識別可能であることを示しています。

この結果は、NanoFCMが自然界に存在するほとんどのウイルスナノ粒子の検出要求を満たす可能性を示しています。

▲COVID-19ワクチンの純度変化
FITCにより蛍光標識された不活化コロナウイルスは数回の精製工程を経てほぼ100%まで上昇

　バイオ医薬品産業においてワクチン製造をはじめとする多くのバイオテクノロジー分野では、ウイルス製剤の純度評価が不可欠です。ウイルス製剤の調製過程では、宿主細胞の溶解液中に、細胞の残骸、空のキャプシド、成熟したビリオンなど、多くの粒子が共存することがあり、高い有効性を維持するためにはその安定性を長期的に追跡することが不可欠となっています。

　上図では、不活化コロナウイルスから作られたCOVID-19ワクチンについて解析しています。新規コロナウイルス1個のサイズ（直径）分布と粒子濃度は、NanoFCMのソフトウェアから直接取得することができます。さらにNanoFCMは高いサイズ分解能と蛍光フェノタイピングによりウイルス粒子の均一性とウイルス粒子純度を評価することもできます。 NanoFCMの解析プラットフォームは、単一のコロナウイルスの定量的かつ多項目解析を可能にし、高感度かつハイスループットなCOVID-19ワクチンの品質管理に大きな可能性を示しています。

　B細胞悪性腫瘍に対するCAR-T細胞療法は、がん治療として初めて米国食品医薬品局（FDA）に承認された細胞療法です。CAR-T細胞療法で最も広く使用されているベクターは、レンチウイルスでありこのレンチウイルスの包括的な特性評価は、CAR-Tの構築を成功させるために非常に重要です。
　レンチウイルスのサイズ分布は直接光散乱検出によって推定しました。RNAは膜透過性核酸色素を使用して標識し、VSV (Vesicular Stomatitis Virus)-Gタンパク質は蛍光標識モノクローナル抗体によって特異的に認識しました。これによりRNAシグナルとVSV-Gシグナルの両方を持つ粒子は有効なレンチウイルスベクターとして同定されます。 レンチウイルスベクターの核酸とタンパク質の同時解析により、培養条件を最適化してウイルスを最大限に生産するだけでなく、カプセルタンパク質を効果的に発現するウイルス株をスクリーニングすることも可能です。
　※VSV-Gタンパク質：Vesicular Stomatitis Virus Gタンパク質

レンチウイルスの大量生産を容易にし、CAR-T療法の普及・応用を加速させることが可能

Nano FCM フローナノアナライザーは、レンチウイルスの濃度や純度を直接測定できるほか、研究開発から製造、精製、品質管理まで、レンチウイルス製造の全工程に適用でき、レンチウイルスの大量生産を容易にし、CAR-T療法の普及・応用を加速させることが可能です。

腫瘍治療のためのがん溶解性アデノウイルス

　Oncolytic Viruses(オンコリティックウイルス)とは複製能力を持つ殺腫瘍性ウイルスの一種であり、標的細胞の腫瘍抑制遺伝子を不活性化して腫瘍細胞に選択的に感染し、その細胞質で自己複製を行い、最終的に腫瘍細胞を死滅させ、同時に免疫反応を刺激し、より多くの免疫細胞を引き寄せて、残存するがん細胞を殺し続けるという特異的な性質を有しています。
　特に腫瘍溶解性アデノウイルス（Oncolytic Adenoviruses：OA）は、前臨床試験および臨床治療の両方で検討されているが、標的への到達性が低いことがOA応用を制限する大きな障害となっている。ここではOAを標的リガンドで遺伝子操作されたバイオエンジニアリング細胞膜ナノベシクル（BCMN）で装飾したことで得られたOA@BCMNは、複数の異種移植モデルにおいて標的送達の強化、ウイルスへの影響性、生存率への有効性を示しました。
　上図ではナノフローサイトメトリーにより、OA@BCMNのカプセル化効率を評価し、CFSEおよびSYTO 62プローブをそれぞれBCMNおよびOAの核酸の標識に適用しました。その結果60%の陽性率が得られ、OAを内包したBCMNナノ構造体の作製に成功したことが示されています。

第一世代計測技術（TEM, NTA）との比較

【上図】95 nmシリカナノ粒子の比較測定の結果です。 NanoFCMはサイズ評価で信頼性が高いTEMと結果が一致します。NTAは20-250 nmのブロードな分布結果です。
【下図】サイズが異なるシリカナノ粒子（47, 59, 74, 95, 123 nm）をミックスし測定しています。 NanoFCMはTEMと相関性が非常に高い高分解能な粒度分布結果を得ることができます。